69
n.8 novembre 2012
rone, composto fluorogenico. I pozzetti gialli appari-
ranno quindi fluorescenti se osservati alla lampada
di Wood alla lunghezza d’onda di 365 nm.
Si conta il numero di pozzetti gialli e fluorescenti e i
risultati vengono espressi in Most Probabile Number
(
MPN)/100 ml.
Studio di comparazione
Per l’equivalenza dei metodi sono stati analizzati in
parallelo 80 campioni di acqua potabile, ai quali è
stata aggiunta acqua di scarico opportunamente di-
luita al fine di ottenere un’acqua contaminata. I dati
raccolti sono stati poi analizzati statisticamente, me-
diante l’analisi di regressione lineare.
Espressione dei risultati
Dall’esame dei campioni analizzati si è evidenziata
un’elevata correlazione pari a 0,96 per E.coli. Per
quanto riguarda invece la ricerca dei coliformi totali,
la correlazione tra i due metodi, pari a 0,78, è risul-
tata buona.
Definita una netta e significativa correlazione tra i
due metodi, si è deciso di effettuare uno studio di
precisione attraverso i parametri di ripetibilità e ripro-
ducibilità al fine di una validazione, secondo i criteri
da l’enzima β-D-glucuronidasi. Anche in questo caso
è prevedibile che la nuova definizione sarà “membro
delle Enterobacteriacee che esprime β-galattosidasi
e β-glucuronidasi”.
Rispetto al metodo ISO 9308-1:2002 che prevede la
filtrazione su membrana (MF) e l’incubazione su un
terreno agar Tergitol 7 TTC, la Tecnologia a Substra-
to Definito (DST) si dimostra più selettiva in quanto
basata sul principio che solo i microrganismi ricercati
riescono ad utilizzare il substrato nutritivo che non
presenta componenti utili alla crescita di eventuali
altri batteri, riducendo quindi la possibilità di falsi po-
sitivi e di falsi negativi.
La tecnica DST è in grado, inoltre, di rivelare in sole
18 -22
ore simultaneamente e senza necessità di
prove di conferma, che richiedono tempi di analisi
più lunghi, sia i batteri coliformi totali, sia i batteri
Escherichia coli.
Materiali e metodi
Il Colilert-18/Quanti-Tray, brevettato da
Idexx
,
è un
metodo a pozzetti multipli che permette di determi-
nare la concentrazione di batteri coliformi a 37°C e
di E. coli in campioni di acqua potabile tramite una
stima statistica calcolata in funzione del numero di
pozzetti positivi ottenuti.
Si aggiunge ad un volume di 100 mL del campio-
ne da analizzare un terreno disidratato contenente
i substrati specifici di nutrimento per questi batteri.
Dopo che il substrato si è sciolto, si versa il campio-
ne in una piastra a pozzetti multipli Quanti-Tray che
viene sigillata e incubata a 36 °C +/- 1 per 18 ore
(
max 22 ore).
Fanno parte integrante del terreno due nutrienti/
indicatori per i batteri bersaglio, l’o-nitrofenil-β-D-
galattopiranoside (Onpg) e il 4-metil-umbelliferil-
β-D-glucuronide (MUG).
Durante il periodo di incubazione i coliformi, se pre-
senti, grazie alla β-galattosidasi, metabolizzano il
nutriente/indicatore Onpg dalla cui idrolisi viene pro-
dotto l’o-nitrofenolo, composto cromogenico che im-
partisce ai pozzetti una colorazione gialla.
Se tra i coliformi è presente anche E. coli, esso ol-
tre a effettuare la reazione β-galattosidasi – Onpg,
grazie alla β-glucuronidasi metabolizza il substrato
MUG dalla cui idrolisi si ottiene il 4-metil-umbellifer-
Retta di regressione di Escherichia coli
Retta di regressione dei Coliformi totali